Le processus de stérilisation dans un autoclave (stérilisateur à vapeur) peut être très délicat. Si, par exemple, des liquides ou des corps solides (instruments, verrerie, filtres, textiles) sont stérilisés pour être utilisés ultérieurement en laboratoire, le processus de stérilisation doit garantir un produit reproductible et stérile à tout moment. Les produits stérilisés en vue d'une utilisation en laboratoire ne peuvent pas faire l'objet d'un test de stérilité, car ils sont contaminés par le test et ne peuvent donc plus être utilisés en laboratoire.
L'autoclave optimal pour vous ?
La validation des processus de stérilisation à la vapeur est un sujet de plus en plus important pour garantir des résultats reproductibles et démontrables. En outre, les aspects de sécurité doivent être pris en compte lors de la stérilisation à la vapeur en général, mais plus particulièrement lors de la stérilisation de liquides. En règle générale, la stérilisation s'effectue à une température de 121 ⁰C. Cela correspond à une pression de vapeur d'environ 2 bars. Ces températures élevées et la pression qui y est associée peuvent présenter un risque potentiel considérable pour l'utilisateur si le processus de stérilisation à la vapeur est mal conçu ou mal exécuté.
La stérilisation de liquides est l'une des tâches les plus exigeantes en laboratoire. Les processus de stérilisation peuvent parfois durer très longtemps, les bouteilles doivent être ouvertes ou au moins aérées, une partie du liquide bout, les liquides peuvent déborder et les bouteilles peuvent même éclater. Une autre question à se poser est de savoir si les liquides contenus dans les biberons atteignent la température de stérilisation souhaitée (p. ex. 121 ⁰C) et quand ceux-ci peuvent également être retirés de l'autoclave en toute sécurité une fois le processus de stérilisation terminé.
Si l'on considère un processus de stérilisation de liquides, celui-ci se compose de trois phases :
La figure 1 illustre graphiquement les différentes phases.
La ligne bleue représente ici la température dans la cuve sous pression de l'autoclave, la ligne rouge la température dans le liquide. On voit clairement que la température souhaitée de 121 ⁰C est atteinte très rapidement dans la cuve sous pression de l'autoclave, tandis que les liquides dans les flacons mettent beaucoup plus de temps à atteindre la température de stérilisation. Pendant la période de chauffage, l'énergie thermique de la vapeur est transférée aux biberons par condensation de la vapeur. Ce processus de condensation et le transfert de chaleur qui en découle prennent un certain temps, ce qui explique la différence de temps entre le simple chauffage du récipient sous pression et le chauffage du liquide lui-même. Le temps nécessaire pour atteindre des températures identiques dans la cuve sous pression de l'autoclave et dans les liquides est appelé temps d'égalisation.
De nombreux autoclaves utilisés aujourd'hui en laboratoire ne sont toujours pas équipés d'une mesure de la température dans un récipient de référence. La température exacte du liquide à stériliser n'est donc pas enregistrée et ne peut donc pas être utilisée pour réguler le processus de stérilisation. Ces autoclaves démarrent le temps de stérilisation lorsque la température souhaitée est atteinte dans le récipient sous pression de l'autoclave. Le temps d'égalisation nécessaire pour que les liquides atteignent également la température souhaitée n'est pas pris en compte. Les liquides n'atteignent donc jamais la température de stérilisation de 121 ⁰C, par exemple, et l'efficacité biologique du processus de stérilisation n'est donc plus assurée. Selon la résistance des microorganismes à inactiver, ceux-ci ne sont que partiellement inactivés ou pas du tout.
Figure 1 - Processus de stérilisation / phases
Mesure de la température dans un récipient de référence
En mesurant la température dans un récipient de référence au moyen d'un capteur de température, il est possible de déterminer la température exacte du liquide à stériliser et de s'en servir également pour réguler le processus de stérilisation. Le temps de stérilisation ne démarre que lorsque la température de stérilisation souhaitée est atteinte dans le liquide. Le récipient de référence est rempli d'eau à cet effet. Il est important de noter que la taille et le niveau de remplissage du récipient de référence doivent correspondre à ceux du plus grand récipient rempli du liquide à stériliser.
Le capteur de température pour la mesure dans un récipient de référence est donc nécessaire pour garantir que la température de stérilisation est atteinte dans le liquide. Mais ce capteur est également nécessaire pour garantir une température de prélèvement sûre une fois la stérilisation terminée. Dans un autoclave, les liquides sont chauffés bien au-dessus de leur point d'ébullition normal (100 ⁰C). La chaleur introduite dans le liquide, associée à la surpression correspondante, peut entraîner des risques importants pour l'opérateur d'un autoclave. Il peut par exemple se produire un retard d'ébullition, c'est-à-dire que le liquide se met à bouillir spontanément à l'ouverture de l'autoclave. Cette ébullition spontanée génère une onde de pression de vapeur et de liquide chaud qui, comme un geyser, jaillit des récipients. Un litre d'eau produit 1000 litres de vapeur !
En raison de ce potentiel de risque considérable, les stérilisateurs à vapeur utilisés pour la stérilisation de liquides sont soumis à des réglementations correspondantes. La norme DIN EN 61010-2-040 exige que les stérilisateurs à vapeur destinés à la stérilisation de liquides soient équipés de dispositifs de sécurité qui empêchent l'ouverture de l'autoclave tant que les liquides n'ont pas été refroidis à une température de prélèvement sûre pour l'utilisateur. La norme définit une température de prélèvement sûre à 20 K en dessous du point d'ébullition de l'eau à la pression atmosphérique ambiante. Cela correspond à une température de prélèvement sûre de 80 ⁰C. Les autoclaves modernes sont équipés d'un système de verrouillage de la porte en fonction de la température et de la pression. Celui-ci empêche l'ouverture de l'autoclave tant que le récipient sous pression est sous pression et tant que la température mesurée dans le liquide est supérieure aux 80⁰C requis.
Le refroidissement des liquides à la température de prélèvement sûre peut prendre beaucoup de temps. Une taille fréquemment utilisée pour les autoclaves dans les laboratoires est un autoclave dont la cuve sous pression a une capacité d'environ 150 litres. Si un tel autoclave est entièrement chargé de flacons contenant le liquide à stériliser, un cycle de stérilisation complet peut durer jusqu'à 10 heures. Cela signifie qu'il n'est pas possible d'effectuer un processus de stérilisation complet en une seule journée de travail. C'est pourquoi il est recommandé d'équiper l'autoclave d'un système de refroidissement par retour, qui réduit considérablement la durée totale de la charge et élimine d'autres dangers et inconvénients liés à la stérilisation des liquides.
Réfrigération rapide - maximiser la productivité et la sécurité
Parmi les systèmes de rétro-refroidissement disponibles pour les autoclaves, il faut en principe distinguer deux types de systèmes de refroidissement.
Le refroidissement par évaporation est probablement le type de refroidissement le plus fréquemment utilisé dans un autoclave. Il peut s'agir, par exemple, de :
Tous les types de refroidissement susmentionnés présentent de graves inconvénients lors de la stérilisation de liquides et peuvent, si le processus de stérilisation n'est pas effectué correctement, comporter un potentiel de risque important, car ce type de refroidissement nécessite une ébullition du liquide à refroidir.
Il est donc recommandé, lors de l'achat d'un autoclave, de définir précisément pour quelles applications il sera utilisé et comment il sera équipé en termes de productivité et de sécurité.
Refroidissement par radiation
Le refroidissement par radiation (refroidissement rapide avec pression de soutien) présente des avantages considérables par rapport au refroidissement par évaporation. Dans le cas du refroidissement rapide par retour d'air avec pression de soutien, le récipient sous pression est refroidi sur toute sa surface par de l'eau froide grâce à des serpentins de refroidissement extérieurs. Avant que le refroidissement ne soit activé après la phase de stérilisation, la vapeur se trouvant dans le récipient sous pression est remplacée par de l'air comprimé filtré et stérile. L'air comprimé empêche de manière fiable l'ébullition du liquide pendant la phase de refroidissement. La chaleur est transférée du liquide par radiation vers les parois froides du récipient sous pression, ce qui refroidit le liquide.
Le refroidissement rapide par pression de soutien permet un gain de productivité considérable, car les temps de processus sont nettement réduits par rapport à l'auto-refroidissement. Alors que l'auto-refroidissement nécessite encore jusqu'à 10 heures pour un processus d'autoclavage complet, le temps de refroidissement par retour rapide avec pression de soutien peut être réduit jusqu'à 60%, selon la quantité de charge. En outre, tous les dangers et inconvénients décrits pour le refroidissement par évaporation (retard à l'ébullition, perte de liquide, ébullition excessive, pas de refroidissement pour les bouteilles bien fermées) sont éliminés de manière fiable, car il n'y a plus d'ébullition du liquide. Avec ce type de refroidissement, les bouteilles peuvent être remplies jusqu'au niveau maximal (gain de productivité de 50 à 70%), il est même possible d'utiliser des bouteilles bien fermées. Il n'est pas nécessaire d'ouvrir ou d'aérer les bouteilles.
Optimiser davantage les temps de processus
Les autoclaves modernes offrent la possibilité d'optimiser davantage le refroidissement des liquides dans les modules. Cela augmente encore la productivité, mais a également une influence sur la qualité des liquides à stériliser. De nombreux liquides contiennent des ingrédients qui ne sont pas très stables à la chaleur. Les liquides doivent certes être stérilisés, mais le temps d'exposition des liquides à la chaleur doit être réduit au minimum afin de ne pas influencer négativement les ingrédients stables à la chaleur.
Module 1 - Ventilateur radial
Le ventilateur radial génère un flux d'air dans la cuve sous pression de l'autoclave pendant la phase de refroidissement. Ce flux d'air force la chaleur des bouteilles à atteindre les parois de la cuve sous pression, refroidies par la pression de soutien du refroidissement rapide par retour. Ce procédé permet de réduire le temps de refroidissement jusqu'à 70% par rapport à l'auto-refroidissement.
Figure 4 - Refroidissement avec pression de soutien et ventilateur radial
Module 2 - Ultracooler
L'Ultracooler est un échangeur de chaleur supplémentaire, refroidi par eau, qui est directement intégré dans la cuve sous pression de l'autoclave. La chaleur des bouteilles peut ainsi être prélevée directement là où elle se trouve : dans la cuve sous pression. Grâce au transfert de chaleur nettement amélioré, le temps de refroidissement peut être réduit jusqu'à 90% par rapport à l'auto-refroidissement.
Remarque : comme le ventilateur radial et l'ultracooler sont installés à l'intérieur de la cuve sous pression, il faut veiller à ce qu'ils ne réduisent pas l'espace utile disponible de l'autoclave.
Lors de la stérilisation de corps solides (p. ex. instruments, verrerie vide, pointes de pipettes dans des boîtes, filtres et textiles) ainsi que lors de la destruction de déchets dans des sachets de destruction, il faut veiller à ce qu'une atmosphère de vapeur soit créée exactement là où elle est nécessaire. C'est-à-dire sur et dans le produit à stériliser. De nombreux autoclaves n'éliminent pas l'air de l'autoclave et du produit de manière fiable. Là où il reste de l'air dans l'autoclave et dans le produit, il n'y a pas d'effet stérilisant, car seule la vapeur transporte l'énergie thermique nécessaire pour inactiver les micro-organismes de manière fiable.
Une purge inefficace
Les figures 5 et 6 montrent l'inefficacité de la purge d'air à l'exemple d'une boîte contenant des pointes de pipettes ainsi qu'un sachet de destruction. Si l'autoclave est simplement chauffé, l'air en est chassé et une atmosphère de vapeur se forme dans la cuve sous pression de l'autoclave, alors que de l'air reste dans le produit à stériliser. L'air qui reste dans le produit empêche la vapeur de pénétrer là où son énergie thermique est nécessaire pour obtenir un effet stérilisant.
L'air à la même température que la vapeur (par ex. 121 ⁰C) contient plusieurs fois moins d'énergie thermique. Pour les produits qui ne peuvent pas être stérilisés dans une atmosphère de vapeur, il existe certes des stérilisateurs à air chaud, mais ceux-ci stérilisent à des températures plus élevées (180 à 250 ⁰C) et pour une durée beaucoup plus longue (jusqu'à plusieurs heures de stérilisation). Un effet stérilisant de l'air à des températures typiquement utilisées dans les stérilisateurs à vapeur de 121 ⁰C à 134 °C et un temps de stérilisation de 3 à 20 minutes, n'existe donc pratiquement pas.
Figure 5 - Désaération inefficace pour les corps solides
Purge efficace
Pour une évacuation complète et reproductible de l'air de l'autoclave et du produit à stériliser, il faut utiliser un pré-vide fractionné. Pour ce faire, l'autoclave est équipé d'un système de vide. Pendant la phase de chauffage, des cycles de vide sont effectués pour éliminer activement l'air, suivis de coups de vapeur. En règle générale, on utilise un pré-vide fractionné en trois parties, mais selon le produit, il peut être nécessaire d'utiliser davantage de fractions.
Séchage pour les solides - Superdry
Pour le séchage, les solides tels que les instruments ou la verrerie vide sont généralement placés dans une armoire de séchage après le processus de stérilisation. Les autoclaves modernes permettent de sécher les corps solides directement après le processus de stérilisation. Stérilisation et séchage en un seul processus. Il n'est pas nécessaire de manipuler davantage les objets à stériliser avec un risque de recontamination.
La stérilisation de substances biologiques dangereuses est un défi particulier. Pendant la phase de chauffage, l'air présent dans l'autoclave est remplacé par de la vapeur. Pour ce faire, l'air est expulsé de l'autoclave et rejeté dans la pièce dans laquelle l'autoclave est installé.
La TRBA 100 - Règles techniques pour les agents biologiques - exige que l'air sortant d'un autoclave dans les laboratoires soit traité à partir du niveau de sécurité S2, car cet air sortant pourrait être contaminé par des micro-organismes provenant du produit à stériliser. Un procédé approprié doit être utilisé à cet effet. Pour les autoclaves, il s'agit généralement de la filtration. Pour ce faire, l'autoclave est équipé d'un filtre d'évacuation. Tout l'air expulsé de l'autoclave passe par le filtre et les micro-organismes y sont retenus. Le filtre est stérilisé "en ligne" pendant le processus de stérilisation afin d'inactiver les micro-organismes qui y sont retenus. La TRBA 100 ne traite que l'air évacué de l'autoclave, et non le condensat qui en résulte. Pendant le processus de stérilisation, la vapeur se condense sur le produit et se transforme donc à nouveau en eau (condensat). Cette eau peut également être potentiellement contaminée par des micro-organismes. C'est pourquoi le condensat doit rester dans l'autoclave pendant le processus de stérilisation et doit également être stérilisé "en ligne" avant d'être rejeté à l'égout après une stérilisation réussie.
La qualification consiste à vérifier si un appareil est adapté à l'utilisation prévue et si un processus, par exemple un processus de stérilisation, peut être réalisé en tenant compte du produit à stériliser, avec toujours le même résultat (reproductible), un produit stérile.
En principe, le processus de qualification se divise en trois parties principales :
L'objectif de la qualification et de la validation est la preuve documentée qu'un appareil est adapté à l'utilisation prévue.
L'effet stérilisant d'un processus de stérilisation à la vapeur est démontré dans les phases OQ (chambre vide) et PQ (avec produit) à l'aide d'instruments de mesure externes pour la température et la pression, ainsi qu'à l'aide de bio-indicateurs basés sur Bacillus stearothermophilus. Alors que les moyens de mesure externes de la température et de la pression prouvent que le système de commande de l'autoclave affiche et documente des valeurs fiables et que le processus de stérilisation se déroule dans les tolérances à définir, les bio-indicateurs apportent la preuve de l'efficacité biologique. Pour placer les bioindicateurs, il faut déterminer dans quelles zones des objets à stériliser il est le plus difficile d'atteindre l'efficacité biologique. C'est précisément dans ces zones que les bioindicateurs doivent être placés, afin de couvrir en quelque sorte le "pire des cas". Toutes les étapes d'une QI, QO et QP doivent être documentées en détail. Dans tous les cas, une coordination étroite entre l'utilisateur et le fabricant est nécessaire pour la réalisation d'une QI, d'une QO et d'une PQ.
Cet article a été publié dans la revue spécialisée GIT Labor-Fachzeitschrift, 7/2016, p. 14-18.
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